(mini)Guida pratica ragionata sull’ibridazione in situ

Prima di tutto, perché avvicinarsi all’ibridazione in situ? Attraverso di essa è possibile ricavare un’informazione posizionale molto precisa di determinati prodotti genici di una determinata linea cellulare o di un tessuto e, se l’esperimento è stato ben progettato, è possibile caratterizzare la finestra temporale del fenomeno. Bisogna stare attenti a non finire nell’errore di comparare l’intensità di diversi marcatori nelle diverse condizioni sperimentali: infatti questa tecnica non può dare nessuna informazione quantitativa se non quella di presenza/assenza in un determinato tipo cellulare.

 

Essendo molto versatile, può essere usata per esaminare target diversi (DNA, mRNA, miRNA) con diversi tipi di sonde (DNA, RNA, oligo) con diversi sistemi di rilevazione (biotina, digossigenina, radioattivo, fluorescenza) e con diversi metodi di conservazione del tessuto (paraffina, crioconservati e whole mount) dando così un ampio margine di sensibilità adatto a vari utilizzi.
Io ne parlerò limitatamente a sonde di RNA marcate con digossigenina che ibridizzano con RNA messaggeri di interesse.
Per iniziare si deve trovare una sequenza antisenso tra le 300 e le 1000 bp (un buon compromesso tra ottima penetrabilità tissutale e ottima ibridazione) del nostro mRNA: possiamo farlo semplicemente cercando in letteratura oppure attraverso l’uso di BLAST (argomento di un post futuro) o altri tools analoghi stando attenti a non utilizzare sequenze che mappino su introni oppure su regioni non tradotte del messaggero. Avuta la sequenza, dovremo fare i controlli di allineamento rituali per essere effettivamente sicuri che riconosca solamente l’acido nucleico da noi cercato. I successivi passaggi vanno dal clonaggio della sequenza ottenuta tramite pcr in un vettore opportuno, la trascrizione in vitro ad opera delle RNA polimerasi fagiche, la preparazione del tessuto per l’analisi e l’ibridazione vera e propria.
Dopo questa introduzione nei prossimi post parlerò più specificatamente degli step utili per portare a compimento l’ibridazione, intanto un sito utile dove recuperare tanti consigli tecnici e non solo è www.immunoportal.com.