L’opinione che mi sono formato leggendo varia letteratura (1 e 2 oltre al buon vecchio Magnatis) riguardo l’utilizzo dei vari tipi di sonde per in situ coincide con la metodica che mi sono trovato ad imparare nel primo periodo del dottorato: sonde a RNA marcate con digossigenina. Questo per vari motivi. Primo, l’appaiamento RNA-RNA sembra essere molto più stabile rispetto al DNA-RNA e causa meno segnale di fondo (in quanto è più facile togliere l’eccesso di sonda non legata ed esiste un rischio minore di formazione di legami aspecifici con DNA genomico di sequenza simile); una “giusta” lunghezza della sonda (tra 300 e 1000 bp) assicura un’ottima specificità di bersaglio e non diminuisce di molto la penetrabilità tissutale rispetto agli oligonucleotidi marcati; infine l’utilizzo di digossigenina legata all’UTP mediante trascrizione in vitro al posto del meno salutare zolfo radioattivo permette una marcatura omogenea e una sensibilità adeguata per rilevare molti tipi di mRNA, con la possibilità di effettuare modifiche al protocollo che permettono l’analisi di prodotti dall’espressione molto bassa (si pensi alla PCR in situ).
Dopo aver trovato e controllato opportunamente la sequenza del gene che ci interessa, ci dovremo preparare i primer per amplificarla tramite PCR eseguita sui cDNA retrotrascritti da opportuni mRNA estratti da una linea cellulare di cui siamo ragionevolmente certi esprima il gene. Ottenuto l’amplificato senza incontrare difficoltà insormontabili (speriamo), non ci resta che inserirlo in un opportuno plasmide che abbia ai lati del polilinker i promotori per due diverse RNA polimerasi fagiche tra T3, T7 o SP6 oltre ad una resistenza ad un antibiotico (un esempio è pBSSK+). Il metodo classico consiste nel tagliare sia l’inserto che il plasmide con due enzimi di restrizione diversi che creino estremità appiccicose che permetteranno un’efficiente clonaggio nel vettore e l’inserimento con un orientamento verificabile. Se siete sfortunati e gli enzimi dell’inserto non sono utilizzabili con quelli del polilinker (non preoccupatevi è la regola) allora dovrete costringervi a tagliare con un’unico enzima di restrizione o con due blunt ends, aumentando la probabilità che il vettore si richiuda su se stesso oppure causando l’inserimento di più molecole di inserto in uno stesso plasmide che, di fatto, diminuiscono di molto l’efficienza di clonaggio. A mio parere, se volete utilizzare l’in situ come indagine di routine, varrebbe la pena comprare kit appositi (dall’estrazione dell’RNA al clonaggio e oltre) che facilitano il compito e garantiscono il risultato, dedicando così il nostro tempo (gratis ma non meno risorsa del denaro) al vero e proprio esperimento che presenta già da solo molte variabili da ottimizzare. In un modo o nell’altro adesso dovremmo avere il nostro ipotetico plasmide contenente l’inserto. Il passo successivo sarà la trasformazione di batteri resi competenti (con il metodo che preferite) attraverso shock termico, ma solamente dopo aver purificato il prodotto clonato con vari passaggi in fenolo e cloroformio e precipitato in alcool. A questo punto i batteri si coltivano in piastre contenenti ampicillina e X-gal per selezionare le colonie bianche che hanno il plasmide con l’inserto rispetto alla maggiorparte blu che avrà il plasmide vuoto (i batteri senza alcun plasmide vengono uccisi dall’antibiotico e non si vedono sulla piastra). Presa la nostra bella colonia bianca (vi consiglio di prenderne di più per aumentare le chance di avere il risultato voluto) la si farà crescere in terreno selettivo e, raggiunta la fase esponenziale di crescita (all’incirca dopo 16 ore) si estrae il plasmide (mini, midi o maxiprep) denaturando tutto il DNA a ph elevato e permettendo la veloce rinaturazione del solo piccolo DNA plasmidico riportando il ph ai valori precedenti. Il plasmide così ottenuto viene quantizzato allo spettrofotomentro e controllato su gel per verificare la reale presenza dell‘inserto rispetto alla corsa di un plasmide vuoto (per vedere il plasmide correre come il peso molecolare di riferimento lo si deve tagliare con un enzima avente un unico sito; infatti un plasmide circolare presenta superavvolgimenti negativi o positivi che lo faranno migrare più o meno velocemente del corrispondente marker).
Ora disponiamo della materia prima per marcare l’inserto con digossigenina attraverso la trascrizione in vitro.
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